Znalazłem bardzo fajną pracę: Designing Genes for Successful Protein Expression, która obejmuje większość czynników determinujących ekspresję białek. Wrzucam jego fragmenty, bo jestem pewien, że niektórym z Was się przyda.
Tłumaczenie można kontrolować na poziomie inicjacji i wydłużania. Inicjacja translacji zależy przede wszystkim od sekwencji miejsca wiązania rybosomu (RBS) i wczesnej struktury drugorzędowej mRNA. Inne determinanty ekspresji białek są gorzej poznane, ale równie silne.
1. Inicjacja translacji
Kluczowym składnikiem wpływającym na inicjację translacji u prokariotów jest RBS , który występuje między 5 a 15 zasadami przed otwartą ramką odczytu (ORF) AUG kodon startowy. Wiązanie rybosomu z sekwencją Shine – Dalgarno (SD) w RBS lokalizuje rybosom do kodonu inicjacyjnego ... Powinowactwo RBS do rybosomu jest krytycznym czynnikiem kontrolującym skuteczność, z jaką nowy inicjowane są łańcuchy polipeptydowe. Ta interakcja współzawodniczy z możliwymi interakcjami parami zasad obejmującymi region RBS, który może tworzyć się w samym mRNA. Zatem sekwencje SD ze słabszym parowaniem zasad do rybosomu są bardziej podatne na interferencję ze strukturą mRNA. Jednak niektóre eksperymenty sugerują, że sekwencje SD o zbyt silnym powinowactwie mogą być szkodliwe, szczególnie w niższych temperaturach, przez hamowanie początkowego wydłużenia. Również krytyczna jest odległość między RBS a kodonem start z 5-7 zasadami od konsensusu SD AGGAGG jest optymalny.
Liczne dowody sugerują, że początkowe 15–25 kodonów ORF zasługują na szczególną uwagę przy optymalizacji genów. Badania wykazały, że wpływ rzadkich kodonów na szybkość translacji jest szczególnie silny w tych pierwszych kodonach, w przypadku ekspresji zarówno u Escherichia coli, jak i Saccharomyces cerevisiae. U E. coli spadek peptydylo-tRNA podczas translacji początkowych kodonów wydaje się być zaakcentowany obecnością rzadkich kodonów NGG. Efekty te wydają się być niezależne od lokalnej drugorzędowej struktury mRNA. Prawdą jest również, że ekspresję można odzyskać przez zamianę sekwencji 5 'nawet dla sekwencji, które nie wykazują szczególnie silnej struktury mRNA lub zawierają rzadkie kodony lub inne oczywiste szkodliwe elementy w tym regionie.
2. Odchylenie kodonów
Drugim sposobem wykorzystania częstotliwości kodonów gospodarza jest dopasowanie częstotliwości kodonów hosta w zaprojektowanym genie. Można to zrobić po prostu wybierając każdy kodon z prawdopodobieństwem odpowiadającym częstości kodonów gospodarza ... Używając zestawów genów o szerokim zróżnicowaniu cech projektu genów, Welch i in. stwierdzili, że zmienność częstotliwości używania synonimicznych kodonów miała głęboki wpływ na ilość białka produkowanego w E. coli, niezależnie od lokalnych efektów sekwencji 5 '. Zaobserwowano zmianę co najmniej dwóch rzędów wielkości w ekspresji z powodu substytucji poza początkowymi 15 kodonami ORF. Ta zmienność była silnie skorelowana z globalną częstością użycia kodonów w genach, chociaż częstości kodonów stwierdzone w wariantach o najwyższej ekspresji nie odpowiadały tym występującym w genomie lub w endogennych genach E. coli o wysokiej ekspresji. Analiza wieloczynnikowa wykazała, że częstości występowania określonych kodonów dla około sześciu aminokwasów mogą przewidywać obserwowane różnice w ekspresji. Nie jest jasne, jakie są biochemiczne podstawy tej korelacji.
3. Struktura mRNA i wydłużenie translacyjne
Chociaż wiele dowodów sugeruje, że struktura mRNA może zakłócać inicjację translacji zarówno u prokariotów, jak i eukariontów, wpływ struktury na wydłużenie jest mniej dobrze poznany. Może to częściowo wynikać z wewnętrznej aktywności helikazy rybosomów, która umożliwia translację nawet przez bardzo silne szpilki do włosów i może uniemożliwić wielu strukturom ograniczenie szybkości translacji u prokariontów lub eukariontów. Co być może ważniejsze, struktura mRNA jest trudna do przewidzenia, szczególnie w przypadku aktywnie tłumaczonych wiadomości, które są w ciągłym przepływie między różnymi stanami złożonymi i rozwiniętymi.
4. Specyficzne dla białka czynniki zapewniające dodatkową złożoność
Białko może być szczególnie niestabilne u żywiciela, zwłaszcza jeśli jest słabo sfałdowane z powodu naturalnej niestabilności, braku wystarczających czynników protetycznych lub nieprawidłowej potranslacyjnej modyfikacja ... Ekspresja białek wydzielniczych i błonowych może być ograniczona przez mechanizmy kierowania tych białek do błony. Jest nawet możliwe, że sekwencja aminokwasów białka może ograniczać wydajność translacji. Na przykład uważa się, że prolina ulega powolnej translacji w E. coli, niezależnie od używanego kodonu.
Ekspresja białka może być toksyczna dla komórki, prowadząc do niestabilności wektor ekspresyjny lub supresja gospodarza syntezy białek ... Powszechną strategią zmniejszania toksyczności jest obniżenie ekspresji do tolerowanych poziomów. Promotory o różnej sile mogą być cennymi narzędziami do znalezienia optymalnej szybkości ekspresji dla maksymalnej wydajności ... Jednym z potencjalnych sposobów uniknięcia toksyczności niektórych białek jest skierowanie ekspresji do peryplazmy lub pożywki. Można to osiągnąć przez fuzję N-końcową sekwencji sygnałowej wydzielania.
Aby uzyskać więcej informacji, przeczytaj cały artykuł. Polecam również przeczytanie Parametry projektowe do kontrolowania ekspresji genów syntetycznych u Escherichia coli.